Гистологические исследования тканей здорового и больного человека. Их отличия

Общие познания в строении тканей и органов, знание основных общих патологических процессов также необходимы сотрудникам современной морфологической лаборатории.
Целью работы является изучение методов гистологического исследования тканей здорового и больного человека.
В рамках поставленной цели решаются следующие задачи:
− изучить процесс приготовления гистологических препаратов;
− изучить гистологические и гистохимические окраски;
− ознакомиться с протоколом проведения иммуногистохимических реакций;
− изучить особенности гистологического исследования тканей опухоли
Объект исследования: гистологические исследования.
Предмет исследования: гистологические исследования тканей здорового и больного человека.
 
Глава 1. Обработка материала для гистологических исследований
1.1. Изготовление гистологических препаратов
Работа патологоанатомической лаборатории с операционным и биопсийным материалом регламентируется Приказом Минздрава РФ № 179-н от 24.03.2016 г. «О Правилах проведения прижизненных патологоанатомических исследований» [1].
Рабочий процесс в гистологической лаборатории представляет собой упорядоченный процесс движения поступающего на исследование материала, включающего в себя строго обязательные этапы, операции которых являются специфичными для гистологической лаборатории и дискретными.
Подготовка материала к исследованию начинается непосредственно после его забора и имеет ряд этапов [8, 10, 16].
Первый этап обработки гистологического материала – его фиксация, целью которой является сохранение объекта в том виде, в каком он находится в живом организме.
Основной фиксирующей жидкостью является 10% нейтральный формалин. Таким способом сохраняется прижизненная структура и обеспечивается возможность изучения ткани.
Следующий этап обработки операционного и биопсийного материала – вырезка, котором врач описывает поступивший на исследование материал, вырезает из крупных объектов информативные фрагменты, помещает их в специальные кассеты.
Затем гистологический материал в кассетах помещается в аппарат для гистологической проводки, где происходит процесс обезвоживания (дегидратации) и обезжиривания, а также уплотнения ткани. При слишком мягкой ткани в процессе изготовления срезов она будет «сминаться», образуя складки, разрывы и другие артефакты, что влияет на непригодность приготовленных препаратов к изучению.
Применение гистопроцессоров позволяет значительно уменьшить время проводки до одного часа при использовании гистопроцессора Xpress 120 за счет применения вакуум-инфильтрационной и микроволновой методик, а также стандартизировать этот процесс.
Заливка – это процесс создания парафинового блока, достаточно твердого, чтобы быть пригодным для микротомирования. В процессе заливки фрагмент ткани заливается жидким парафином или специальными средами для заливки. Затем залитую ткань остужают до затвердевания блока.
Изготовление срезов (микротомирование или нарезка) производится на специальном приборе – микротоме, это процесс изготовления тонких парафиновых срезов. Толщина срезов, предназначенных для световой микроскопии, не должна превышать 4-5 мкм.
Окрашивание срезов позволяет выявить структуру ткани за счет неодинакового химического сродства различных элементов ткани к гистологическим красителям. Например, окраска гематоксилином и эозином позволяет выявить кислые структуры ткани, такие как ДНК и РНК, при связывании их с гематоксилином, который имеет щелочную реакцию, и цитоплазму клеток, которая окрашивается с эозином.
Перед окрашиванием срез монтируется на предметное стекло. После микротомирования срез помещают на поверхность подогретой воды в водяную баню для предупреждения формирования складок. В воде срез расправляется, а потом уже помещается на предметное стекло.
Окрашивание, как и все остальные стадии процесса изготовления гистологического препарата, может выполняться вручную и автоматически.
Заключение срезов представляет собой помещение окрашенного среза, монтированного на предметном стекле. Срез помещается под покровное стекло с использованием среды для заключения.
Среды, применяемые для заключения гистологических препаратов, имеют коэффициент преломления, близкий к таковому у стекла – это полистирол, канадский бальзам, специальные среды для заключения.
Храниться заключенный препарат может достаточно длительное количество времени. Гистопрепарат, заключенный в полистирол, может храниться в течение всего срока хранения истории болезни пациента, т.е. 25 лет [1].
1.2. Высокотехнологичные методы в работе гистологической лаборатории
В настоящее время для исследования операционного и биопсийного материала кроме рутинных гистологических методов, применяются также современные высокотехнологичные методы.
Иммуногистохимическое исследование в последние десятилетия стало мощным двигателем развития клинической (прижизненной) гистологии. Эти исследования могут быть выполнены только в гистологической лаборатории, поскольку перед проведением такого исследования и назначением панелей антител необходимо достоверно определить структуру и тип анализируемой ткани, выделив в ней нормальные и атипичные клетки, инвазивный компонент опухоли. Такие исследования дают принципиально новую, более детальную по сравнению с гистологическими и гистохимическими методами, информацию о свойствах изучаемых объектов (клеток и тканей) [16].
В основе любой иммунологической реакции лежит взаимодействие антигена с антителом, которое приводит к формированию комплекса «антиген-антитело».
Антигены - чужеродные вещества сложной органической природы, способные при попадании в организм вызывать иммунные реакции. Небольшой участок антигена, с которым будет связываться антитело, называется эпитопом.
Антитела - вещества белковой природы, которые образуются в организме в ответ на антигены и, специфически взаимодействуя с ними, уничтожают их, обеспечивая гуморальный иммунитет. Антитела обладают специфичностью к антигенам, т.е. связываются только с тем антигеном, на который вырабатывались.
Антитела принадлежат к группе белков иммуноглобулинов - близкие по химическому строению и свойствам глобулярные белки, которые обладают способностью соединяться с антигенами. Антигены, попадая в организм, способствуют образованию антител. Для проведения иммуногистохимических реакций к данному фрагменту присоединяют биотин, флуорохромы или ферменты.
Антитела, которые используются в иммунологических методиках, получают путем повторной иммунизации различных животных (чаще мышей, кроликов, крыс, овец, лошадей и др.) определенным антигеном. После выработки антител у иммунизированного животного берут сыворотку крови и очищают ее от других сывороточных белков.
Большие молекулы стимулируют множество линий В-клеток, которые синтезируют несколько видов антител к разным частям молекулы одного и того же антигена. Получаемые антитела называют «поликлональными», они являются смесью антител к различным фрагментам антигена.
Моноклональные антитела представляют собой продукт одного клеточного клона плазматических клеток, таким образом все антитела являются иммунологически идентичными и реагируют с одной частью антигена, к которой они были получены.
Важнейшим этапом любого иммуногистохимического метода является визуализация результатов реакции «антиген - антитело». Антитела обладают свойством прочно связываться с тканевыми антигенами, при этом не связанные антитела можно удалить отмыванием срезов. Поскольку окрашенные продукты реакции являются нерастворимыми, они оседают в месте взаимодействия антител. Для выявления образовавшегося в процессе реакции комплекса «антиген - антитело», используют различные метки: ферменты, биотин, флуорохромы, металлы.
В качестве окрашенных меток в настоящее время широко используются пероксидаза хрена и щелочная фосфатаза. Окисление пероксидазы хрена с помощью 3-диаминобензидина тетрахлорида придает продуктам реакции коричневую окраску, в то время как щелочная фосфатаза формирует нерастворимые продукты, которые в зависимости от используемого красителя