Тема ВКР «Особенности идентификации бактерий рода Enterococcus и определение их лекарственной чувствительности»

слаборозовый цвет, а колонии подвижных энтерококков в зависимости от индивидуальных особенностей штамма вырастают окрашенными или бесцветными. По этой схеме можно делать посевы всех, стерильно взятых, биологических жидкостей. Если необходимо исследовать до подвида, то можно обратиться к общей схеме, согласно приложению 1.
1. Выделение энтерококков из мочи.
1 мл мочи центрифугируют при 3000 об/мин, 30 минут. Осадок наносят на чашку со средой ЕФ и ведут инкубацию 18-24 часа при 37°С. Если на чашке есть колонии, то есть энтерококк E. faecalis.
4. Бактериологическое исследование на кишечный дисбактериоз.
1 г фекалий разводят в 9 мл физиологического раствора, из полученной взвеси готовят десятикратные титры вплоть до 1:100000. Из двух последних разведений наносят по 0,1 мл на среду ЭДДС, после идет инкубация, 12 часов, 37°С. Количественно энтероккоки определяются по числу колоний, умноженному на степень разведения и на 10. Расчет идет на 1 г фекалий.
5. Бактериологическое исследование при пищевых токсикоинфекциях.
Жидкие пищевые продукты нейтрализуют до pH 7,2-7,4 (если необходимо), твердые пищевые продукты отбирают по 20-25 грамм и добавляют примерно такое же количество 0,1% пептонной воды. Далее готовятся десятикратные разведения 0,1% пептонной водой до 10-7. Каждое разведение наносят на среду ЭДДС. Инкубируют при 37°С, 18-24 часа. Далее оценивают количество энтероккокков аналогично пункту 5. Опционально использование среды ЕФ.
6. Выделение энтерококков с различных предметов, материала и оборудования больниц.
Готовят смывы объёмом 0,2 мл, засевают на среду ЖЩА. параллельно засевают такой же объем в среду накопления (сахарный бульон, 6,5% хлористого натрия). Инкубация 24 часа, 37°С. Если есть колонии, то идентификацию проводят согласно общей схеме, в соответствии с приложением 1 [2, 12, 18, 19, 20].
2.4 Методы идентификации энтерококков в санитарной микробиологии
Так же идентификацию энтерококков проводят не только в области здравоохранения, но и в области контроля качества продуктов питания (мясная и молочная отрасли), поэтому есть отдельные методики идентификации энтерококков, утвержденные Роспотребнадзором.
Для исследования энтерококков в интересуемых объектах используют посевы на твердые или жидкие питательные среды. Прямой посев на элективные питательные среды с последующим подсчетом выросших колоний следует проводить при исследовании продуктов с относительно высоким содержанием энтерококков (сырое молоко, творог и творожные изделия). Результаты на плотных питательных средах учитывают через 24—48 ч инкубации при 37°С.
При небольшом обсеменении продуктов энтерококками (молоко пoслe пастеризатора, пастеризованное молоко) рекомендуется проводить посев в жидкую среду накопления. Этот посев подразумевает под собой два этапа: посев в среду накопления и подтверждающий тест.
Методика определения с использованием твердых питательных сред. Готовятся десятикратные разведения исследуемого продукта в соответствии со стандартным методом.
В качестве питательных сред необходимо использовать среду Пейкера (Packer) или молочную среду с полимиксином по Г. П. Калине.
Расплавленные и охлажденные до 45-48°С питательные среды заливаются тонким слоем (примерно 1 см) в чашки Петри. После застывания чашки со средой могут быть использованы для посевов или хранится в холодильнике при температуре +4°С в течение 7-10 дней. Из исследуемых разведений в зависимости от цели исследования (при определении энтерококков как санитарнопоказательных высеиваются 1-4 разведения продукта; при пищевых отравлениях - 4-7 разведения) берутся по 0,1 мл и высеваются на подсушенную поверхность питательной среды Пейкера или Г. П. Калины. Высеянный материал тщательно втирается шпателем в поверхность питательной среды, но без нарушения целостности ее рельефа. Посевы инкубируются в термостате при температуре 37°С в течение 48 ч [2, 8, 10, 20].
Типичные колонии энтерококков обладают округлой формой, ровными краями, блестящей поверхностью, диаметром 1,5-2 мм и фиолетовой окраской на коричнево-красном фоне среды Пейкера или красной с зоной протеолиза на светло-голубом фоне среды Г. П. Калины. Подсчитываются все типичные колонии, и число их пересчитывается на 1 г или 1 мл продукта. 3-5 колоний отсевается на скошенный агар для дальнейшей идентификации. Посевы культивируются при температуре 37°С в течение 24 ч [2, 8].
Из колоний, которые выросли на скошенном агаре, готовятся мазки и окрашиваются по Граму. Одновременно определяется их каталазная активность. Для этого на очищенное обезжиренное стекло наносят каплю 1%-ного водного раствора пероксида водорода и в нем растирают петлю культуры. Если при этом отсутствует выделение пузырьков газа, значит, реакция отрицательная. Грамположительные каталазоотрицательные диплококки изучаются по шести тестам Шермана:
− температурные границы роста от 10 до 45°С;
− рост при 6,5% NaCl;
− рост при рН 9,6;
− рост в желчи или 40%-ном желчном бульоне;
− рост в молоке с 0,1%-ным метиленовым голубым;
− терморезистентность (выдерживают при температуре 60°С в течение 30 мин) [2, 10, 20].
Для ускоренной дифференциации культуры можно высеивать только на бульон, который содержит 40% желчи и имеет рН 9,6. Одновременно для рядовой дифференциации культуры высеваются на среды, которые содержат теллурит калия, 2,3,5-ТТХ, кровь, молоко, сорбит, маннит и раффинозу.
Определение с использованием жидких питательных сред. Готовятся десятикратные разведения в соответствии со стандартным методом. В роли питательных сред применяются щелочно-полимиксиновая среда (ЩЭС), желчно-нитратная среда, среда Эндо с кристаллическим фиолетовым и полимиксином.
При небольшом обсеменении молочных продуктов энтерококками 1 мл продукта и соответствующих разведений засеваются в пробирки со средой ЩЭС. Посевы инкубируются при температуре 37°С в течение 24-48 ч. Из каждой засеянной пробирки петлей пересеваются образцы на чашки Петри с подсушенной желчно-цитратной средой или средой Эндо с кристаллическим фиолетовым и полимикснном. Посевы выдерживаются при температуре 37°С в течение 24 ч.
Типичные колонии энтерококков на желчно-цитратной среде круглые, с ровными краями, диаметром 1,5-2,0 мм, розово-красного цвета, а на среде Эндо с кристаллическим фиолетовым и полимикснном - ярко-красного. При присутствии типичных колоний энтерококков на чашках Петри определяется титр, в котором были найдены энтерококки в исследуемом продукте [2, 20].
Для более быстрой дифференциации E. faecalis можно использовать сорбитный агар. К 1 л мясопептонного агара добавляют 10 г сорбита и 600 мг индикатора конго-красного, которые предварительно растворены в 5-7 мл дистиллированной воды (для лучшего растворения можно нагреть компоненты, но не доводя раствор до кипения, оптимальная температура около 55°С), хорошо перемешиваются и разливаются в чашки Петри. Среда будет иметь интенсивно-красную окраску.
Наличие энтерококков в посевном материале следует учитывать через 16-18 ч роста при температуре 37°С. Точечные колонии S. fеаcalis и его вариантов будут обладать черной окраской, появляясь на поверхности бесцветной вокруг них среды. E. faecium и E. faecium var. durans, которые не ферментируют сорбит, будут образовывать точечные колонии без изменения цвета среды.
Так же существуют коммерческие наборы для выделения и идентификации энтерококков, например, «Селективная плотная питательная среда для выделения энтерококков, готовая к использованию, Энтерококковый (азидный) агар», изготавливаемая Центральной Фабрикой Готовых Сред. Эта среда предназначена для выделения и количественного определения бактерий рода Enterococcus из исследуемого материала при проведении микробиологической диагностики in vitro с целью поддержки диагностики инфекционных заболеваний, а также выявления источников инфекции. Входящий в состав среды пептон обеспечивает высокие питательные свойства среды. Дрожжевой экстракт служит источником витаминов, декстроза - углеводов. Азид натрия служит селективным агентом, угнетая рост грамотрицательных микроорганизмов. В качестве индикатора используется трифенилтетразольхлорид, который переходит в нерастворимую форму и окрашивает колонии энтерококка в розово-красный цвет [8, 10, 20].
2.5 Полимеразная цепная реакция для идентификации бактерий рода Enterococcus
Наиболее специфичным и современным методом идентификации энтерококков в частности, и любого микроорганизма в целом, является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для энтерококков часто выбирают видоспецифический ген, кодирующий синтез супероксиддисмутазы. Для каждого вида энтерококков можно подобрать праймеры, согласно таблице 2, которые будут специфичны и продукты ПЦР с их участием можно будет идентифицировать на гель-электрофорезе с 1-2% агарозным гелем 1 [5, 8].
Таблица 2 - Праймеры для ПЦР-детекции 23 видов энтерококков.
Штамм Праймер Последовательность (5’-3’) Размер продукта (п.н.)
E. asini ATCC 700915 AS1 GCATCATGACAAGCATCACGC 365
AS2 GGCTTTTTGCCTTCAGATAAA
E. avium ATCC 14025 AV1 GCTGCGATTGAAAAATATCCG 368
AV2 AAGCCAATGATCGGTGTTTTT
E. casseliflavus ATCC 25788 CA1 TCCTGAATTAGGTGAAAAAAC 288
CA2 GCTAGTTTACCGTCTTTAACG
E. cecorum ATCC 43198 CE1 AAACATCATAAAACCTATTTA 371
CE2 AATGGTGAATCTTGGTTCGCA
E. columbae ATCC 51263 CO1 GAATTTGGTACCAAGACAGTT 284
CO2 GCTAATTTACCGTTATCGACT
E. dispar ATCC 51266 DI1 GAACTAGCAGAAAAAAGTGTG 284
DI2 GATAATTTACCGTTATTTACC
E. durans ATCC 19432 DU1 CCTACTGATATTAAGACAGCG 295
DU2 TAATCCTAAGATAGGTGTTTG
E. faecalis ATCC 19433 FL1 ACTTATGTGACTAACTTAACC 360
FL2 TAATGGTGAATCTTGGTTTGG
E. faecium ATCC19434 FM1 GAAAAAACAATAGAAGAATTAT 215
FM2 TGCTTTTTTGAATTCTTCTTTA
E. flavescens ATCC 49996 FV1 GAATTAGGTGAAAAAAAAGTT 284
FV2 GCTAGTTTACCGTCTTTAACG
E. gallinarum ATCC 49673 GA1 TTACTTGCTGATTTTGATTCG 173
GA2 TGAATTCTTCTTTGAAATCAG
E. gilvus ATCC BAA-350 GI1 CTGGCTGGGCTTGGCTAGTGA 98
GI2 ATAATCGGTGTTTTACCGTCT
E. hirae ATCC 8043 HI1 CTTTCTGATATGGATGCTGTC 187
HI2 TAAATTCTTCCTTAAATGTTG
E. malodoratus ATCC 43197 MA1 GTAACGAACTTGAATGAAGTG 134
MA2 TTGATCGCACCTGTTGGTTTT
E. mundtii ATCC 43186 MU1 CAGACATGGATGCTATTCCATCT 98
MU2 GCCATGATTTTCCAGAAGAAT
E. pallens ATCC BAA-351 PA1 TGGCACCAAATGCTGGCGGAA 160
PA2 TGGTGTAGAAGTAATTTCAAG
E. porcinus/villorum ATCC 700913 PO1 TGGTTTCTGATATGGATGCGA 280
PO2 GTAATCGCTAATTTCTCTCCA
E. pseudoavium ATCC 49372 PV1 TCTGTTGAGGATTTAGTTGCA 173
PV2 CCGAAAGCTTCGTCAATGGCG
E. raffinosus ATCC 49427 RF1 GTCACGAACTTGAATGAAGTT 287
RF2 AATGGGCTATCTTGATTCGCG
E. saccharolyticus ATCC 43076 SA1 AAACACCATAACACTTATGTG 371
SA2 GTAGAAGTCACTTCTAATAAC
E. seriolicida ATCC 49156 SE1 ACACAATGTTCTGGGAATGGC 100
SE2 AAGTCGTCAAATGAACCAAAA
E. solitarius ATCC 49428 SO1 AAACACCATAACACTTATGTGACG 371
SO2 AATGGAGAATCTTGGTTTGGCGTC
E. sulfureus ATCC 49903 SU1 TCAGTGGAAGACTTAATCGCA 173
SU2 CCAAATGTATCTTCGATCGCT

Также стоит упомянуть метод электронной микроскопии, с помощью которого можно идентифицировать энтерококки, но его использование нецелесообразно из-за сложности и дороговизны [5].
2.6 Методы определения лекарственной чувствительности бактерий рода Enterococcus
Бактерии рода Enterococcus являются условно-патогенным микроорганизмами для человека и обладают высокой антибиотикорезистентностью к широкому спектру лекарственных препаратов, в том числе и к антибиотикам нового поколения [4, 6, 15].
В настоящее время существуют несколько современных методов определения резистентности бактерий рода Enterococcus к антимикробным препаратам:
1. Диско-диффузионный метод
2. Метод серийных разведений
3. Определение антибиотикочувствительности на панелях
4. Метод Е-теста.
Диско-диффузионный метод основан на способности антибактериальных препаратов проникать из пропитанных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост посеянных на агаре бактерий. Для определения чувствительности этим методом используют только стандартизированные качественные диски. После наложения дисков и инкубации культуры, рассматривают зоны подавления роста бактерий вокруг дисков. Чем больше зона подавления, тем меньше резистентность бактерий к этому антибиотику.
Для проведения исследования сначала делается разведение культуры – готовится инокулюм (стандартный суспензия исследуемой культуры с концентрацией 1,5·10 КОЕ/мл Для этого стерильным тампоном берется мазок с чашки Петри с выросшей культурой микроорганизма и разводится в 5 мл изотонического раствора. Приемлемым результатом для энтерококков является мутность в пределах 0,5 ед по Мак Фарланду.
Далее разведенная культура пересевают на кровяной агар несколькими способами:
1. Раствор культуры наносится небольшой каплей, а затем шпателем или стерильным тампоном растирается на всю чашку Петри;
2. Большая капля раствора культуры наносится на чашку Петри, затем покачивающими движениями равномерно распределяется по всей чашке. Остатки можно удалить пипеткой.
Затем засеянная среда подсушивается на воздухе и после этого на поверхность среды проводится нанесение дисков с определенным набором антибиотиков. Далее чашку Петри с антибиотиками термостатируют в течении 1-3 суток в термостате и по истечении этого срока просматривают результат. Если энтерококк чувствителен к антибиотику, то вокруг определенного диска образуется зона подавленного роста, то есть будет наблюдаться отсутствие роста бактерий.
Результаты исследования, представленные на рисунках 6,7,8 были предоставлены лаборантом отдела клинической микробиологии ГБУЗ «Диагностический центр (центр лабораторных исследований) ДЗМ»
Для определения лекарственной чувствительности энтерококковых бактерий можно использовать, например, использован набор антибиотиков фирмы БИО РАД. В данный набор входят: ампициллин, ципрофлоксацин, гентамицин, левофлоксацин, линезолид и ванкомицин, согласно рисунку 6.

Рисунок 6 – наименование антибиотиков набора БИО РАД
Перед нанесением дисков с антибиотиками чашку Петри визуально делят на 6 секторов, затем с помощью диспенсера антибиотики наносят на поверхность питательной среды, в соответствии с рисунком 7.

Рисунок 7 – нанесение антибиотиков на чашку Петри
На рисунке 8 представлен результат определения лекарственной чувствительности к антибактериальным препаратам бактерий E. Faecalis.


Рисунок 8 – Результат определения антибиотикорезистентности диско-диффузным методом
Согласно рисунку 8, E. faecalis проявил наибольшую чувствительность к ампицилину (1), ванкомицину (5) и линезолиду (6). К ципрофлоксацину, гентамицину и левофлоксацину E. faecalis проявил резистентность [4, 6, 10, 12, 19].
Метод Е-теста (эпсилометрический метод) так же, как и диско-диффузионный метод, основан на подавлении роста бактерий. На тест-полоску нанесены последовательные разведения антибиотика от меньшего к большему. Процедура проведения теста проста: тест–полоска с реагентом кладется на поверхность засеянного агара. После инкубации результат